酒精灯,培养瓶,培养 液,PBS,0.25%胰酶,超净工作台、二氧化碳培养箱、倒置显微镜,显微镜,计数板,离心机,恒温水浴箱,冰箱(4℃、-20℃、-70℃),液氮 罐,冻存管,冻存液,废液缸等
小鼠,生理盐水,100ml灭菌烧杯,15ml离心管,培养皿,滴管,无菌镊子、剪刀,筛网,泡沫板,大头针
取出小鼠后沥干酒精,放入超净台内,固定在泡沫板上。
用镊子提起皮肤,用解剖剪剪开皮肤一个横切口,将皮肤向上撕开,然后剪开肌肉等,暴露出腹腔,在左侧找到脾脏,用弯头眼科镊取出脾脏,置于无菌培养皿中。
将筛网置于平皿中,脾脏置于筛网上,用弯头镊镊住,轻轻在筛网上进行碾磨,同时不停滴加不含血清的培养液冲洗。
将碾磨好的细胞悬液吸入至离心管中,离心(1000rpm,5min),吸去上清(去除血液等)。
加入10ml培养液,吹打混匀,取样计数。
将稀释好的细胞悬液分装于培养瓶中,轻轻摇晃混匀,在培养瓶上面做好标志,注明细胞、组别及日期。然后将培养瓶置于二氧化碳培养箱中培养。
倒置显微镜下观察细胞形态,确定细胞是否需要传代。
培养液瓶打开后,过酒精灯火焰,置酒精灯火焰周围。
拿出直头滴管,套上橡皮吸头,过火,放入培养液瓶中。
打开培养瓶,瓶口过火,将培养瓶内的培养液轻轻倒入废液缸,用2-3mLPBS洗去残留的旧培养基。
培养瓶加入0.25%胰酶(大约2ml)用量以薄薄盖满一层为宜,37℃消化,倒置显微镜下观察到细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶,使细胞脱离胰酶,然后将胰酶倒掉,加入少量的含血清的新鲜培养基。
取弯头滴管反复吹打细胞使其脱壁并分散,再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养基,制成细胞悬液,然后分装到新培养瓶中。盖上瓶盖,适度拧紧后再稍回转,以利于CO2气体的进入,将培养瓶放回CO2培养箱。
对半贴壁培养细胞,不需胰酶,直接吹打,加入新鲜培养基,然后分装到各瓶中。
吸取传代后的细胞悬液,离心,去除培养液,加入冻存液,分装冻存管(冻存管内细胞数目一般为(5~10)×10万个/ml,2ml冻存管中一般放1~1.5ml细胞)。
冷冻保存方法一:标准的冻存程序为降温速率-1~-2℃/min;当温度达-25℃以下时,可增至-5~-10℃/min;到-100℃时,则可迅速浸入液氮中。
冷冻保存方法二:冷冻管置于已设定程序之程序降温机中每分钟降1~3℃至-80℃以下,再放入液氮长期保存。
取出冷冻管,立即放入37℃水浴箱中快速解冻,轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化,移入无菌操作台内。
打开冻存管,将细胞悬液吸到离心管中。
1000rpm离心10分钟,弃去上清液。
加适当培养液后将细胞转移至培养瓶中,37℃培养,第二天观察生长情况。