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Pacbio RS II 三代测序,迟到的礼物

Pacbio RS II是Pacific Biosciences 公司研发的单分子实时测序系统(single molecule, real-time,SMRT),其专利 SMRT cell 中进行的,每个 SMRT cell 中有 150,000 个 ZMW(纳米级的零模波导孔 zero-mode waveguides), 每个 ZMW 都能够包含一个 DNA 聚合酶及一条 DNA 样品链,SMRT Cell 能够平行检测大约 75,000 个单分子测序反应。 天津生物芯片三代测序平台自2013年运行至今,作为国内最早一批提供三代测序服务的机构,现已成功利用三代测序技术完成细菌、真菌、昆虫、动植物、人类等数百个物种的基因组、全长转录组测序及分析工作,并开发建立了基于三代测序技术的靶向测序、宏基因组测序、表观遗传测序、以及单细胞测序系列方案。天津生物芯片于2016年9月,又率先引进了Pacific Biosciences公司最新推出的三代测序旗舰平台——Sequel。Sequel平台在PacBio RS II的基础上做了全面系统地升级,在读长、通量和准确率等方面都具有显著优势,升级后的系统,更加符合大数据量、长读长的宏基因组学研究的需求。
工具/原料

SMRT cell chip(小拇指指甲盖大小)。一条strip可以放8个SMRT cell,仪器一次可运行2条strip,共16个SMRT cell 文库构建试剂盒,测序试剂盒

方法/步骤
1

一,样品质检1、PCR产物送样标准:(1)未纯化产物:样品目的条带清晰,无杂带,体积小于50μL,,总量应大于1μg;体积大于50μL,总量应大于2μg;(2)纯化产物:若切胶纯化,琼脂糖凝胶的染料不能是溴化乙锭EB,样品目的条带清晰,无杂带,纯化后体积小于50μL,总量应大于300ng。2、DNA送样标准:(1)DNA样本避免反复冻融,避免紫外线、荧光染料等可能损伤DNA的环境或物质,请尽可能提供新制备的DNA,低温运输;(2)DNA溶解在TE buffer或EB buffer中;(3)样品要求无色、透明、不粘稠;(4)凝胶电泳结果:主条带明显无明显降解现象,基因组DNA条带长度≥23kb(特殊种类请标注DNA大小),胶孔无蛋白,无RNA污染;(5)DNA总量要求:真菌、放线菌门、昆虫、植物及海洋生物,单次建库起始DNA总量≥30µg(Qubit),浓度>80ng/μL(Qubit);其他样品,单次建库起始DNA总量≥15µg(Qubit),浓度>40ng/μL(Qubit);(6)根据每个课题设计的建库数量不同,总共所需要的DNA量也不同;3、RNA收样标准(1)样品类型:完整的、DNase处理过后的Total RNA.,RNA提取的过程中避免蛋白污染;(2)样品总量 ≥ 20μg;浓度 ≥300 ng/μL;(3)样品纯度: OD260/280≥1.8,OD260/230 ≥1.8;RNA 28S:18S ≥ 1.4,RIN ≥ 8.0。

2

二,建库

3

三,BluePinpin 片段筛选

4

四,上机测序

5

五,应用1、全基因组 de novo 测序2、基因组草图的优化及基因组完成图绘制3、全长转录本测序4、宏基因组测序5、16S rDNA 全长6、细胞器基因组测序 7、全基因组重测序&稀有变异鉴定8、表观遗传学

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