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活体成像实验中荧光素D-luciferin,钾盐的制备

在活体动物体内成像实验中,一般是将Firefly luciferase基因(由554个氨基酸构成,约50KD)即荧光素酶基因整合到预期观察的细胞染色体DNA上以表达荧光素酶,培养出能稳定表达荧光素酶的细胞株,当细胞分裂、转移、分化时, 荧光素酶也会得到持续稳定的表达。基因、细胞和活体动物都可被荧光素酶基因标记。将标记好的细胞接种到实验动物体内后,当外源(腹腔或静脉注射)给予其底物荧光素(D-luciferin,potassium salt ,sciencelight luc001),即可在几分钟内产生发光现象。这种酶在ATP,氧存在的条件下,催化荧光素的氧化反应才可以发光,因此只有在活细胞内才会产生发光现象,并且发光光强度与标记细胞的数目线性相关。荧光素(D-luciferin,potassium salt ,sciencelight luc001)由于诸多优点得到广大科研人员的青睐,主要特点如下:(1) 荧光素不会影响动物的正常生理功能。(2)荧光素是280道尔顿的小分子,水溶性和脂溶性都非常好,很容易穿透细胞膜和血脑屏障。(3) 荧光素在体内扩散速度快,可通过腹腔注射或尾部静脉注射进入动物体内。腹腔注射扩散较慢,持续发光长。荧光素腹腔注射老鼠后约1min后表达荧光素酶的细胞开始发光,10min后强度达到稳定的最高点,在最高点持续约20~30 min后开始衰减,约3h后荧光素排除,发光全部消失,最佳检测时间是在注射后15~35min之间;若进行荧光素静脉注射,扩散快,但发光持续时间很短。科研人员根据大量的实验总结出荧光素的合适的用量是150mg/kg,即体重20克的小鼠需要3毫克的荧光素。(4) 观察时间的间隔没有最短限制,只要观察的条件控制一致就可以。虽然底物在动物体内有一定的代谢过程,但是上一次底物的残留曲线可以知道,可以控制对下一次观察结果的影响。
工具/原料
1

sciencelight D-luciferin,potassium salt ,luc001

2

无菌水

3

完全培养基

4

无菌PBS,w/o Mg2+、Ca2+

5

注射器滤膜过滤除菌,0.2 μ m

方法/步骤
1

体外生物发光试验荧光素试剂的制备材料—D-荧光素,钾盐(D-luciferin,potassium salt ,sciencelight luc001)—无菌水—完全培养基步骤1. 用无菌水制备200X荧光素原液(30mg/ml),轻轻颠倒摇动至荧光素完全溶解。混匀后立即使用或分装后-20℃冻存。*提示:可以用33.3 mL蒸馏水溶解1.0 g D-荧光素钠盐,配制成100 mM的储存液(200×,浓度30mg/ml)。也可以按实验需要量进行配置。2. 将D-luciferin,potassium salt 溶解于预热好的组织培养基中制备成浓度为150 μg/ml的工作液。用组织培养基1∶200稀释储存液,配置工作液(终浓度150μg/mL)。3. 去除培养细胞的培养基。4. 图像分析前,向细胞培养板中添加1×荧光素工作液,然后进行图像分析。—注射器滤膜过滤除菌,0.2 μ m*提示:成像前在37℃下对细胞进行短时间孵育可增强信号。

2

体内生物发光试验荧光素试剂的制备材料—D-荧光素,钾盐(D-luciferin,potassium salt ,sciencelight luc001)—无菌PBS,w/o Mg2+、Ca2+—注射器滤膜过滤除菌,0.2 μ m步骤用无菌PBS配制D-荧光素钾盐工作液(15mg/mL),0.2 um滤膜过滤除菌。按10 uL/g剂量,给予150mg/kg荧光素工作液。(例如,10g的小鼠注射100 μl工作液,被给予1.5mg荧光素。)腹腔注射荧光素10-15 min后进行成像分析。*需要对每个动物模型做荧光素动力学研究以确定峰值信号获取时间。

注意事项
1

D-luciferin,potassium salt ,sciencelight luc001 放在-80度冰箱避光保存,保质期1年

2

D-luciferin,potassium salt ,sciencelight luc001 配制好的溶液,4度保存,1个月内用掉,否则活性会降低。

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