CRISPR-Case9载体构建步骤

2. sgRNA表达盒制备每个sgRNA表达盒按以下体系进行反应：1 μl            10×Cutsmart Buffer 10-20 ng   pYLsgRNA （取20ng）ATP（终浓度0.5-1.0 mM）（取1.0 mM）0.3-0.5 μl adapter（终浓度0.03-0.05 μM）3 U              BsaI-HF20 U            T4 DNA 连接酶（用1×T4 DNA ligase buffer稀释）ddH2O加至终体积10 μlPCR反应，37℃ 5 min ，20℃ 5min，5个循环。注意：不要用热盖，同时避免酶过量、反应时间过长。

3. PCR第一轮PCR：将上一步得到的sgRNA表达盒稀释10倍，按Phanta 25 μl体系进行反应（此轮反应中，每个目的编辑基因包含两个独立反应）：2×Phanta Buffer     12.5 μl10×dNTP                 0.5 μl引物                         1 μl +1 μl（UF/RP，FP/gR-R，FP和RP分别为adapter正反向引物）sgRNA-adapter       1.5 μlPhanta                       0.5 μlddH2O                      7.5 μl反应程序：预热      95℃   5 min变性      95℃   15 s退火      60℃   15 s延伸      72℃   20 s最终延伸  72℃   10 min28个循环第二轮PCR（将第一轮PCR产物稀释10倍，将目的编辑基因对应产物等量混合）：预热      95℃   5 min变性      95℃   15 s退火      58℃   15 s延伸      72℃   40 s最终延伸  72℃   10 min30个循环切胶回收扩增sgRNA盒对应长度：LacZ-OsU6a-sgRNA=832 bp; OsU6a-sgRNA=629 bp; OsU6b-sgRNA=515 bp; LacZ-OsU3m-sgRNA=767 bp; OsU3msgRNA=564 bp

4. Cas9载体构建设置如下反应：1.5 µl     10×CutSmart bufferATP （终浓度1.0 mM, 或加1µl 10 x NEB T4 DNA ligase buffer）60-100 ng    pYLCRISPR/Cas910-100 ng    sgRNA cassettes10 U              BsaI-HF40 U              T4 DNA ligaseddH2O至15 µsgRNA盒对应量：1      10 ng2      20-30 ng3      40-50 ng4      60-70 ng载体和插入片段摩尔比：1:4-6。PCR反应：37℃ 10 min10℃ 5 min20℃ 5 min以上3个循环37℃ 3 min10℃ 5 min20℃ 5 min以上10个循环。