最近小编收到很多问题,其中一个就是下面小编为大家整理一下关于样品采集与处理方法的步骤,希望这些方法能够帮助到大家。
方法/步骤
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首先,在感染实验开始后,于Oh, 3h,6h, 12h,24h,48h从各PHB浓度梯度的取样重复组中随机取虾3尾, 自对虾的头胸甲后插人围心腔取血淋巴液。
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然后,加人等体积EDTA抗凝剂置于离心管中,4°C,8 000 r/min,离心10 min,取沉淀提取RNA。
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然后,再提取RNA及cDNA合成,RNA提取采用Trizol法,cDNA合成使用PrimeScript'TMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)试剂盒进行。DNA提取及WSSV含量测定,取对虾肌肉组织提取DNA。
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然后,再DNA经0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测,要求不含大量蛋白质及降解的DNA片段。使用超微量紫外分光光度计(Biodropsis B0-2000)测定DNA含量及吸光度比值(要求在OD260 m/OD280 m=1.8- 2.0),在确保DNA质量的情况下。
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然后,将溶液稀释至20 ng/pL, -80*C保存用于 Wssv含量检测。基因相对表达量测定,超氧化物歧化酶基因(sod),溶菌酶基因(lzm)和谷胱甘肽过氧化物酶基因(gsh-px)引物设计方法,抗菌肽基因(abp)引物设计。
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最后,设计过氧化物酶基因(cat)引物序列根据, NCBI CAT cDNA序列设计,18S引物序列设计,所有引物均由生物技术合成,引物序列。
注意事项
上述方法为小编整理所得,希望能够帮助到大家。
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