实验护具
实验器材
一. 制作标准曲线(测定细胞具体数量)1、首先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量,然后接种细胞到培养板内。2、按照比例(例如:1/2比例)依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度,一般要做3-5个细胞浓度梯度,每个浓度建议3-6个复孔。3、接种后培养2-4小时使细胞贴壁,然后加CCK试剂培养一定时间后测定OD值,制作出一条以细胞数量为横坐标(X轴),OD值为纵坐标(Y轴)的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞的数量(使用此标准曲线的前提是实验的条件必须要一致,便于确定细胞的接种数量以及加入CCK后的培养时间。)
二. 细胞活性检测1、在96孔板中接种细胞的悬液(100μL/孔)。将培养板放在培养箱中预培养一段时间(37℃,5% CO2)。2、向每孔加入10 μL CCK溶液(注意不要在孔中生成气泡)3、将培养板在培养箱内孵育1-4小时。
4、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。5、若暂时不测定OD值,可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液,并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定,吸光度并不会发生改变。
三. 细胞增殖-毒性检测1、在96孔板中配置100μL的细胞悬液。将培养板放在培养箱预培养24小时(37℃,5% CO2)。2、向培养板加入10μL不同浓度的待测物质。3、将培养板在培养箱孵育一段适当的时间(例如:6、12、24或48小时)。
4、向每孔加入10μL CCK溶液(注意不要再孔中生成气泡,它们会影响OD值的读数)。5、将培养板在培养箱内孵育1-4小时。6、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。7、若暂时不测定OD值,就可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液,并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定,吸光度不会发生变化。
1.白细胞可能需要培养较长时间。2.当使用标准96孔板时,贴壁细胞的最小接种量至少为1,000 个/孔 (100 μL 培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低,因此推荐接种量不低于2,500 个/孔 (100 μL 培养基)。如果要使用24孔板或6孔板实验,请先计算每孔相应的接种量,并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK溶液。3.如果没有450nm的滤光片,就可以使用吸光度在430-490 nm之间的滤光片,但是450nm滤光片的检测灵敏度最高。
建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入CCK试剂后的培养时间。
有条件的情况下建议采用多通道移液器,可以减少平行孔间的差异。加入CCK试剂时,建议斜贴着培养板壁加,不要插到培养基页面下加,容易产生气泡,会干扰OD值读数