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三代测序技术:16S 全长rDNA测序研究

由于大多数微生物不可培养, 近年来基于“应用现代基因组学技术直接研究自然 状态下某一有机群落的全部微生物而无需分离单一菌株”的宏基因组学逐步显现出巨大优势,以其革命性的方法克服了大多数微生物的不可培养性, 并取得了丰硕成果。      我们知道,在以16S/18S rRNA基因或ITS区域为目标序列的菌群结构多样性测序研究中,罗氏454、Illumina等二代测序平台一般只能对单个或连续的两三个可变区序列进行测序分析,通常情况下无法获得rRNA基因全长序列的信息,因而往往难以在属、种甚至菌株等精细水平识别测得的序列,并获取对应的微生物物种信息。这不免有些可惜:辛辛苦苦获得了海量的测序数据,结果却难以精确鉴定其中的微生物类群,菌群中大量成员对应的物种信息仍处于“一问三不知”的状态,对于众多研究者无形中造成了一种信息资源的“浪费”,是一个亟待攻克的难题。
方法/步骤
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天津生物芯片利用PacBio公司的RS II测序系统,则有望从根本上一举解决上述困扰众多研究人员的心头之痛。

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首先,利用PacBio公司专利的单分子实时测序技术(Single molecule real-time sequencing,SMRT),可以对DNA序列实现单分子级别的超长读长测序,因而非常容易读取微生物的rRNA基因全长序列;

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其次,通过PacBio所独有的环形一致性测序模式(Circular-consensus sequence,CCS),可以极大地提高单碱基测序的准确率,一般而言,将rRNA基因全长序列循环测序5~6次后,获得的一致性序列的准确率可以达到99.99%(QV40)以上,远远超过了二代测序的准确率,从而充分保障获得的rRNA基因全长序列的精确性。     基于以上两点,PacBio的SMRT测序技术能够大大提高我们在种甚至菌株等精细水平解析菌群结构多样性的能力。

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具体实验流程1,宏基因组提取 ;2,16S rDNA全长扩增;3,  三代测序,4, 数据分析

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具体案例    在过去的一段时间,高通量二代测序短读长 16s 测序代替了大多数长读长的 Sanger 测序法来研究环境微生物的组成。但随着测序技术的不断发展,对在不同生态系统中微生物群落特征的鉴定分辨率则提出了更高的要求。本文主要通过PacBio 三代全长 16s 和二代 16s V4 区来研究湖水样本的微生物多样性,结果显示,三代全长在种属鉴定上多样性更丰富,减少了模糊不清的种属的分类范围,提高了种属鉴定的分辨率和准确度。同时,三代全长 16s 鉴定出了更多的在湖水不同深度下关于氮循环和产甲烷相关的菌种,而在二代测序中这种微生物的丰度被严重低估。

注意事项
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土壤、淤泥、沉积物≥ 15g;粪便≥ 5g;组织样本≥ 10g

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水体送样为过滤后的滤膜 ( 最适滤膜直径 3-4cm,孔径大小一般选择 0.22μm 或者 0.45μm); 拭子样本≥ 10 个

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DNA(请使用干冰或冰袋运送) DNA:总量≥ 1.6μg;DNA,要有明显主带,无降解,无 RNA、蛋白质等杂质污染

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