间接免疫荧光验证A和B蛋白在SY5Y细胞的共定位

Day1：爬片(盖玻片)的处理(1) 将干净的细胞玻片(若玻片不干净，则提前在酸缸中浸泡12h后，用清水冲洗30遍，干净后即可)放入75%酒精中，浸泡2h后取出晾干。(2) 然后将其放入含有0.1%多聚赖氨酸培养皿中，在37℃，5% CO2培养箱中过夜(玻片包被多聚赖氨酸时尽量避光)。Day2：细胞分盘(1) 紫外线消毒无菌操作台30min，预热10%DMEM培养基及PBS。操作前，用75%的酒精擦拭双手、操作台及常规用品。(2) 将多聚赖氨酸包被的玻片取出，用过滤ddH2O清洗2次(必须用清水轻轻清洗一下玻片，否则其会影响细胞的生长状态)。自然晾干后，放入35mm中备用。(3) 将第3代状态良好的SY5Y细胞按5×105个/皿，接种至放有玻片的35mm中(建议以细胞悬液的形式接种，具体情况见后续的注意事项1)，37 ℃，5%CO2培养箱中培养16h(本实验主要观察细胞形态，建议接种时细胞密度不要太大)。

Day3：间接免疫荧光实验(1) 紫外消毒无菌操作台30min，预热10%DMEM培养基和PBS。操作前，用75%酒精擦拭双手、操作台及常规用品。(2) 将细胞状态良好，贴壁30~40%左右的SY5Y从培养箱取出，弃去陈旧培养基，用PBS清洗，1 min×2次(轻柔晃动，尽量不要使玻片在培养皿中晃动)。(3) 弃去PBS，加入1mL 4%多聚甲醛，在4℃冰箱中固定30min。(4) 弃去4%多聚甲醛，用PBS清洗，1 min×2次。(5) 弃去PBS，加入1mL 10%山羊血清(稀释液：PBS)，室温下封闭30min。(6) 用针头(提前可以将针头前方夹弯，便于挑起35mm中的玻片)和镊子将玻片挑出，正面向上(存在细胞的为正面)，放在干净的载玻片上，做好标记。用吸水纸吸取玻片上多余的水分(用吸水纸将玻片周边的水分尽量洗干净，以免往玻片上加入一抗时扩散)。(7) 取150μL配制好的一抗(A抗体1:50；B抗体1:50。稀释液：PBS)，滴加在爬    片上，37℃孵育2h(在EP管中配制好一抗，从玻片的正中滴加，保证玻片上各个地方都充满一抗，但是又不溢出玻片外，放入湿盒中，避免玻片干燥)。(8) 吸水纸吸去一抗，用PBS清洗细胞3 min×3次，用吸水纸吸取多余的PBS(用加样枪吸取PBS，垂直冲洗细胞即可；SY5Y细胞冲洗力度可以大一些，避免背景洗不干净，若是293T细胞，则冲洗力度相对较小，以免细胞贴壁不牢，漂浮起来；冲洗3min后倒掉玻片上的PBS，用吸水纸将周边的水分)。(9) 后续过程必须在避光条件下完成。(10) 将150μL荧光二抗(罗丹明标记抗体1:100；稀释液：PBS)滴加在玻片上，放入湿盒中，37℃避光孵育2h(注意事项同一抗)。(11) 弃去二抗，PBS清洗细胞3 min×3次，用吸水纸吸取多余的PBS(注意事项同洗一抗)。(12) 将150μL荧光二抗(FITC标记抗体1:100；稀释液：PBS)滴加在玻片上，放入湿盒中，37℃避光孵育2h(注意事项同一抗)。(13) 弃去二抗，PBS清洗细胞3 min×3次，用吸水纸吸取多余的PBS(注意事项同洗一抗)。(14) 取一个新的载玻片，滴加少许甘油，将上述玻片正面向下，进行封片，在激光共聚焦显微镜下观察。

注意事项：1.        在Day2向35mm中接种细胞时，向1.5ml 10%DMED培养基中，加入5×105个SY5Y细胞，在加入15μl双抗，制成细胞混合液，然后沿着爬片的周边滴加细胞悬液(细胞悬液加入35mm中，分布会比较均匀；但是，由于玻片被多聚赖氨酸包被过，容易使细胞贴壁，不建议直接滴加到玻片上，造成细胞聚团，密度过大)。2.        在用PBS冲洗一抗二抗时，建议配置1000ml PBS，冲洗的力度不要太柔，以免清洗不干净，会使得背景很脏很乱。若背景不干净，建议延长冲洗时间或者是冲洗次数。3.        本实验同时孵育两种一抗，彼此之间不受影响，配制体系为150μl=3μl A一抗+3μl B一抗+144μl PBS。两种二抗一起孵育，会影响FITC荧光的反应，因此将两种二抗分开孵育细胞，由于FITC稳定性相对来说比较差，容易淬灭，因此先孵育罗丹明的二抗，最后孵育FITC二抗(孵育二抗一定要避光)。