平台简介:第三代基因测序技术又被为"Single Molecule Real Time (SMRT™) DNA Sequencing"（单分子实时DNA测序技术），该方法基于纳米孔的单分子读取技术，不需要扩增即可快速读取序列。目前，Pacific Biosciences公司已经成功推出了商业化的第三代测序仪PacBio RS平台，使得第三代测序正式走入人们的视角。PacBio RS II是Pacific Biosciences公司研发的单分子实时测序系统（Single Molecule Real Time, SMRT），其专利的SMRT Cell含有15,000个纳米级的零模波导孔（zero-mode waveguides, ZMWs），每个ZMW都能够包含一个DNA聚合酶及一条DNA样品链进行单分子测序，并实时检测插入碱基的荧光信号。
技术特点ü 利用测序过程聚合酶反应的动力学变化，首次实现对碱基修饰进行直接测序。ü 超长的读长：平均测序读长能达到7,000-8,000bp，最长读长能达到3,0000bp；ü 准确率高：对基因组组装和基因组变异检测，可以最多达到99.999%的准确率；ü 敏感性强：可以检测频率在0.1%的minor variants；ü 无PCR扩增偏好性：样本不需要进行PCR扩增，避免了覆盖度不均一和PCR artifacts；ü 最小的GC偏好性（GC bias）：在极端高GC和极端低GC区域，可以轻松测定，从而保证序列的均匀覆盖度。
数据产出试剂盒 平均读长 数据量/SMRT CellP4-C2 Chemistry 5.5-6Kb ~200MbP5-C3 Chemistry 8-10Kb ~250Mb
应用领域（1）全基因组de novo测序与二代测序最高不超过1kb的读长相比，PacBio RS II的长读长将有效解决短序列数据的拼接难题。同时，与二代测序的模板样品需要扩增相比，PacBio RS II无需扩增可直接对单个分子进行测序，有效避免了PCR扩增偏好性和GC偏好性，PacBio RS II可轻松跨越GC含量异常（过高或过低）及高度序列重复的区域，实现序列覆盖的完整性和均一性。（2）基因组草图的优化或基因组完成图绘制对前期已开展测序的动植物、微生物基因组结合三代长读长测序数据进行完善和提升。针对前期已经开展全基因组测序，获得基因组草图的动植物、微生物等，可以结合PacBio RS II平台长读长reads进行补充，从而快速获得前期没有测得的信息及提升基因组的完整度。另外还可以针对前期没有检测获得的结构变异信息（structural-variation events）、串联重复序列信息（tandem duplication）、易位信息（Inversion）等。尤其在微生物基因组完成图的绘制中，可在一天之内、成本低于$1,000即可将基因组完善获得0 gap contig。（3）全长转录本测序PacBio RS II的长读长可实现全长转录本测序，并使基因可变剪接形式的识别成为可能，因此可以对新基因及其isoform进行更全面的研究。同时，长读长不再需要对RNA-Seq的reads进行组装，因此可以更完整的对基因模型和转录的基因进行更全面的注释，用以改进参考基因组中的基因注释信息。（4）宏基因组测序长读长reads能够更为精准地鉴定水体、土壤、肠道等生境中微生物的种类的鉴定，能够更加快捷地获得更多微生物种的全基因组序列。（5）16S rDNA全长测序PacBio RS II的平均读长为8-10Kb，而16S rDNA长度大约为1540bp，因此结合该平台测序可以成功测序获得16S的全长序列。（6）细胞器基因组测序叶绿体基因组和线粒体基因组序列都包含重复序列、反向重复序列等复杂结构，PacBio RS II的长读长可直接跨越这些区域获得这些细胞器的全基因组序列信息等，基因组组装不依赖于是否有近缘物种的线粒体和叶绿体基因组信息等、重测序能够检测到全面的SNPs及indel信息。（7）全基因组重测序&稀有变异鉴定PacBio RS II长读长测序reads无GC偏号，能够全面获得基因组的遗传变异，包括SNPs的鉴定到CNV、SV结构变异等，可运用至人类癌症基因组重测序等。PacBio RS II平台测序周期在10 hours小时即可完成测序，可应用至需要快速反馈的临床检测中，如细菌感染疾病中细菌的鉴定、病毒的鉴定等，取样开展重测序和目前已有的细菌、病毒基因组数据库进行比对鉴定即可。（8）表观遗传学PacBio RS II利用测序过程聚合酶反应的动力学变化，首次实现对碱基修饰进行直接测序。当碱基有额外修饰时，DNA聚合酶的合成速度会减慢，对应的信号会被检测出来。每种碱基修饰事件都会使聚合酶的“停顿模式”PacBio RS II产生微小差异，最终反映到荧光脉冲信号的间隔上。除了甲基化修饰，还可以检测5-hC、5-hmU、5-hU、1-mA、6-mA、8-oxoA、BPDE、6-mT、6-mG等碱基修饰，甚至可以鉴别传统亚硫酸氢盐测序法无法区分的甲基化修饰和羟甲基化修饰。PacBio平台可以在测序的同时即可检测表观遗传学修饰信息，只需对测序数据选择合适的软件即可分析碱基修饰信息。
第一代测序技术-Sanger链终止法一代测序技术是20世纪70年代中期由Fred Sanger及其同事首先发明。其基本原理是，聚丙烯酰胺凝胶电泳能够把长度只差一个核苷酸的单链DNA分子区分开来。一代测序实验的起始材料是均一的单链DNA分子。第一步是短寡聚核苷酸在每个分子的相同位置上退火，然后该寡聚核苷酸就充当引物来合成与模板互补的新的DNA链。用双脱氧核苷酸作为链终止试剂（双脱氧核苷酸在脱氧核糖上没有聚合酶延伸链所需要的3－OH基团，所以可被用作链终止试剂）通过聚合酶的引物延伸产生一系列大小不同的分子后再进行分离的方法。测序引物与单链DNA模板分子结合后，DNA聚合酶用dNTP延伸引物。延伸反应分四组进行，每一组分别用四种ddNTP（双脱氧核苷酸）中的一种来进行终止，再用PAGE分析四组样品。从得到的PAGE胶上可以读出我们需要的序列。。
第二代测序技术-大规模平行测序大规模平行测序平台（massively parallel DNA sequencing platform）的出现不仅令DNA测序费用降到了以前的百分之一，还让基因组测序这项以前专属于大型测序中心的“特权”能够被众多研究人员分享。新一代DNA测序技术有助于人们以更低廉的价格，更全面、更深入地分析基因组、转录组及蛋白质之间交互作用组的各项数据。市面上出现了很多新一代测序仪产品，例如美国Roche Applied Science公司的454基因组测序仪、美国Illumina公司和英国Solexa technology公司合作开发的Illumina测序仪、美国Applied Biosystems公司的SOLiD测序仪。Illumina/Solexa Genome Analyzer测序的基本原理是边合成边测序。在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。以Illumina测序仪说明二代测序的一般流程，（1）文库制备，将DNA用雾化或超声波随机片段化成几百碱基或更短的小片段。用聚合酶和外切核酸酶把DNA片段切成平末端，紧接着磷酸化并增加一个核苷酸黏性末端。然后将Illumina测序接头与片段连接。（2）簇的创建，将模板分子加入芯片用于产生克隆簇和测序循环。芯片有8个纵向泳道的硅基片。每个泳道内芯片表面有无数的被固定的单链接头。上述步骤得到的带接头的DNA 片段变性成单链后与测序通道上的接头引物结合形成桥状结构，以供后续的预扩增使用。通过不断循环获得上百万条成簇分布的双链待测片段。（3）测序，分三步：DNA聚合酶结合荧光可逆终止子，荧光标记簇成像，在下一个循环开始前将结合的核苷酸剪切并分解。（4）数据分析
第三代测序技术-高通量、单分子测序被称为第三代的测序的He-licos单分子测序仪，PacificBioscience的SMRT技术和Oxford Nanopore Technologies 公司正在研究的纳米孔单分子测序技术正向着高通量 低成本 长读取长度的方向发展。不同于第二代测序依赖于DNA模板与固体表面相结合然后边合成边测序，第三代分子测序，不需要进行PCR扩增。（1）Helico BioScience 单分子测序技术。该测序是基于边合成边测序的思想，将待测序列随机打断成小分子片段并用末端转移酶在 3' 末端加上 poly(A),以及在poly(A)的末端进行荧光标记和阻断，把这些小片段与带有poly(T)的平板杂交成像来获得已经杂交模板所处的位置，建立边合成边测序的位点加入聚合酶和被Cy3荧光标记脱氧核苷酸进行DNA 合成，每次只加入一种脱氧核苷酸，然后将未参与合成的dNTP和DNA聚合酶洗脱，直接对Cy3成像，观测模板位点上是否有荧光信号，然后化学裂解核苷酸上的燃料并释放加入下一种脱氧核苷酸和聚合酶的混合物，进行下一轮反应。（2）Pacific BioscienceSMRTT技术。该测序也是基于边合成边测序的原理，这项技于使用了Zero-ModeWaveguide(ZMW)(零级波导)。测序的过程：被荧光标记磷酸集团的核苷酸在聚合酶活性位点上与模板链结合（每种脱氧核苷酸被不用颜色的染料标记），被激发出荧光，在荧光脉冲结束后，被标记的磷酸集团被切割并释放，聚合酶转移到下一个位置，下一个脱氧核苷酸连接到位点上开始释放荧光脉冲，进行下一个循环。（3）Oxford Nanopore Technologies 的纳米孔单分子测序技术。大多数纳米孔测序技术的基本原理是当DNA分子或者它的组成碱基从一个孔洞经过时而检测到被影响的电流或光信号。OxfordNanopore 测序技术是以α- 溶血素来构建生物纳米孔，核酸外切酶依附在孔一侧的外表面，一种合成的环糊精做为传感器共价结合到纳米孔的内表面。这个系统被镶嵌在一个脂双分子层内，为了提供既符合碱基区分检测又满足外切酶活性的物理条件，脂双分子层两侧为不同的盐浓度在适合的电压下，核酸外切酶消化单链 DNA，单个碱基落入孔中，并与孔内的环糊精短暂的相互作用，影响了流过纳米孔原本的电流，腺嘌呤与胸腺嘧啶的电信号大小很相近，但胸腺嘧啶在环糊精停留是时间是其他核苷酸的2-3倍，所以每个碱基都因其产生电流干扰振幅是特有的而被区分开来