hplc提高分离效果的方法

高效液相色谱

合适的流动相

合适的色谱柱

首先需要了解一下分离度的概念，分离度的公式如下图的公式：附上峰形图，可以更好的理解其中的表达式其中，tR1和tR2分别是峰1和峰2的保留时间；W1和W2分别是峰1和峰2在峰底（基线）的峰宽，即通过色谱峰的拐点所作三角形的底边长度。当R>1.5时，两峰可以完全分离。

提高分离度，即是提高分离度公式中R的值，从公式中可以看出，可以通过提高相对保留时间以及降低峰宽来实现，当然这只是理论方案，那么实际应用中如何实现呢?

一、相对保留时间取决于组分及色谱柱其固有的热力学性质，两组分的保留时间差异越大，即固定相对组分的选择性越高；而两峰底宽越窄，表示柱效越高。因此选择合适的固定相非常重要，可以达到提高分离度的效果，同时选择合适的流动相及流动相比例也可以提高分离效果。

二、增加柱温可以提高大多数情况下的分离效果。（注意不是所有都适用）

三、可以使用离子对试剂。用于分析电离能力较强的样品，其原理是将分析物上的离子进行结合，形成在色谱柱上有保留的分子。常用的离子对试剂有：用于酸性化合物的： 四丁基氢氧化铵、四丁基溴化铵、十二烷基三甲基氯化铵用于碱性化合物的： 戊烷磺酸钠、己烷磺酸钠、庚烷磺酸钠、辛烷磺酸钠、癸烷磺酸钠

其实分离度公式还有另一种表达方式，可以方便大家理解实际应用，公式如下图，其中N为柱效，α为选择性，k为容量因子，下面进行详细一点的介绍

一、柱效(Efficiency)，跟前面提到的一样，柱效越高，分离度越好，即选择色谱柱，另可通过两种方式增加塔板数来提高分离度：使用长柱或双柱串联，或者使用细粒径填料的色谱柱，其中，前者会带来分离时间延长的问题，后者对液相色谱系统有更高的要求，随科技发展，工作效率提高，后者更可取一些

二、选择性(selectivity），指色谱柱-流动相体系分离两种组分的能力。主要与固定相、流动相组成有关。提高选择性为提高分离效果的最有效最可操作的办法，落实到实际中，即是色谱柱和流动相的选择。以反相模式为例，反相色谱柱(例C18)是以分配作用对化合物进行保留的，不同化合物的分离基于它们在键合相与流动相中分配系数的差异，如果两种化合物的水溶性、在烷烃-水体系的分配系数等方面存在明显差异，那么这些化合物通常是能够利用反相柱达到分离；PH柱对具有苯环的化合物具有特殊保留。正相模式下，硅胶柱、胺基柱、氰基柱与带有极性基团的化合物之间存在极性相互作用，对化合物的基团具有选择性，常常用于结构类似物、异构体化合物的分离。流动相方面，降低流动相的洗脱强度通常可以增大分离度；而有机溶剂类型也会影响分离，比如反相条件下，乙腈和甲醇的选择性就存在很大差异，而这种差异需要在实践中摸索，但无论如何，多种溶剂类型带给我们更多的实现分离的可能。

三、容量因子，随容量因子增大分离度增加，提高容量因子的方法为增加键合相密度，另外改变键合基团类型也能改变k值。但从上面的公式中可以看出，k对于分离效果的提高的作用较为有限。