2 材料和方法2.1 实验菌种和试剂 谷氨酸棒状杆菌TG866、0.9%生理盐水、50%葡萄糖、20%尿素、2mol/L盐酸、2mol/L氢氧化钠2.2 实验仪器 722光栅分光光度计、不锈钢机械搅拌自动发酵罐（BIOTECH-10JS-100JS）、葡萄糖-谷氨酸分析仪（SBA-40C）、落地式双层全温度培养摇床（ZHWH-2112）、生化培养箱（ZSD1270）、高速台式离心机、灭菌锅、烧杯、量筒、三角瓶、玻璃棒、试管、漩涡振荡器、比色管2.3 10-100L发酵罐2.3.1 发酵罐的主要部件及作用 罐体：主要用来培养发酵各种菌体，密封性要好（防止菌体被污染）罐体当中有搅拌浆，用于发酵过程当中不停的搅拌；底部通气的Sparger，用来通入菌体生长所需要的空气或氧气；罐体的顶盘上有控制传感器，最常用的有pH电极和DO电极，用来监测发酵过程中发酵液pH和DO的变化控制器，用来显示和控制发酵条件等等。2.3.2 发酵罐的附加装置 搅拌机（多级或无级变速）；无菌呼吸气孔（或无菌正压器）；进、出料口 ，无菌采样口；人孔 ，冷、热水进、出口；温度计 ，CIP清洗喷淋头；空气压缩机；高压蒸气锅；自动化电子显示仪2.3.3 发酵罐的使用方法操作步骤1)、电极和溶氧电极；2)、灭菌。根据需要将培养基配入罐体，按要求封好后将罐体放入大灭菌锅灭菌（115℃，30min）；3)、冷却后，将其置于发酵台上，安装完好；打开冷却水，打开气泵电源，连接通气管道开始通气，调节进气旋钮使通气量适当；打开发酵罐电源，设置温度、pH、搅拌速度等， 640r/min下开机转动30min，设定溶氧电极为100；4）、温度稳定，各项参数都正确后，将预摇好的种子接入，开始发酵计时，并开始记录各种参数；5）、酵完毕后清洗罐体和电极，将电极插入有4M氯化钾的三角瓶中待用。2.4 培养基2.4.1 活化斜面培养基 葡萄糖（1g）、蛋白胨（1g）、牛肉膏（1g）、酵母膏（0.5g）、NaCl(0.25g)、琼脂（1.5g）、pH 7.0-7.2 、32℃2.4.2 种子培养基 葡萄糖（6.5g）、酵母膏（10g）、尿素8（分消）、K2HPO4（0.35g）、MgSO4（0.2g）、pH 7.0-7.2、32℃2.4.3 发酵培养基 葡萄糖（24g）、酵母膏（1.2g）、K2HPO4（1.05g）、KH2PO4（0.3g）、尿素8（分消）、MgSO4（0.24g）、pH 7.2-7.52.5 实验方法2.5.1 菌种的活化 取斜面保藏菌种通过划线法接种于10支活化斜面大试管中，32℃下恒温培养20h-24h。2.5.2 种子培养 将1支生长良好的大好试管的活化斜面的种子用1ml生理盐水洗下，吸取1ml菌液转入装有60ml种子培养基的500ml三角瓶中，9层纱布封口，置于摇床中240rpm，32℃下培养12h-14h至对数生长后期。2.5.3 摇床发酵培养法 按10%接种量将种子液3ml接入装有27ml发酵培养基的10个500ml三角瓶中，9层纱布封口，置于摇床中240rpm，32℃下培养发酵36h-40h，每两小时检测一次OD值、残糖含量、谷氨酸产量，做好记录。2.5.4 菌种的生长测定（吸光度法） 用可调微量移液器吸取0.5ml的菌液置于离心管中，8000r/min下离心2min，去上清液0.1ml并稀释至10ml，用生物传感仪（用前需用标准葡萄糖标定）检测残糖含量和谷氨酸产量；离心管中剩下的菌体加少许蒸馏水用漩涡振荡器振荡使菌体振碎并混合均匀，倒入比色管中稀释至10ml，用722光栅分光光度计测定在620nm下的吸光度。2.5.5 发酵罐的发酵培养方法 按10%的接种量将已经准备好的菌液接入10-100L的发酵罐中，自动控制调节pH值、温度、搅拌速度、溶解氧、补料等，在32℃-36℃下发酵36h-40h，并每隔两个小时用同样的方法检测发酵罐中的菌液的OD值、残糖含量和谷氨酸的产量等。2.6 发酵过程的控制 在正常的发酵生产中，我们一般控制的要素为发酵转化率、发酵产酸、发酵周期、发酵理论酸和发酵液质量等关键指标，而在控制发酵转化率的过程中，往往会因为控制的偏差或控制手段不力，更甚者因控制方法不当，造成转化率提高困难或反其道而行之，同时在指标的提高方面难度更大。 针对生产中菌体量变化可适当以变应变控制，减少损失。①在菌体量增加的情况下，可以适当增加投糖量。具体的方法是：在检测中如果残糖含量低于30时，在下次检测前加入0.5ml葡萄糖；如果含量低于20时，则需要加入1ml的葡萄糖②另外，遇到菌体量减少时，可以减少流加糖的量，从而减少投糖总量，压缩发酵周期，降低残糖，减少损失。③在取出0.5ml出来检测之前要先检测菌液的pH值，如果低于7.2则需要加入尿素调节pH到7.5左右；如果高于7.2或者7.5，则不用调节。
3 结果和分析3.1 TG866的生长曲线 此次试验中我们对尿素设置了浓度梯度，来观察尿素浓度对TG866的生长的影响，在1、2试样中加入了0.81ml尿素，在3、4中加入了0.945ml尿素，在5、6中加入了1.08ml尿素，在7、8中加入了1.215ml尿素，在9、10中加入了1.35ml尿素，然后根据OD值的平均值与时间做的图如图所示。 结果及分析： ⑴、从图中我们可以看出，在尿素的梯度在0.81ml左右时，相对其他的几种梯度来说，TG866菌种的生长势头相对较好。 ⑵、从图中的曲线看，和标准的生长曲线有些出入，在16小时和18小时的时候最反常，可能有以下的一些原因：检测前的pH调节没按要求来；添加葡萄糖的时候没按要求来；也有可能是检测时弄错溶液了等原因。 ⑶、图中在16h-18h时候，第一梯度到第三梯度都是下降，而第四梯度和第五梯度确实上升，分析原因可能是第四和第五中污染了其他的杂菌，经过初步分析可能是噬菌体。
3.2 TG866生产谷氨酸含量曲线 TG866在不同梯度下的尿素浓度下的产酸情况如下图所示： 结果和分析：从图中可以看出在不同梯度尿素浓度下，对谷氨酸的产生没有大的影响，去除几个误差较大的点可以知道各个梯度下的谷氨酸产量都差不多。
3.3 TG866菌种转移到发酵罐中的情况3.3.1 发酵罐中菌液的OD值于时间的关系在对发酵罐中的菌液每隔两个小时的检测中，我的实验结果记录如下：
3.3.3 结果和分析 在采用生物素缺陷型菌株的谷氨酸发酵生产中，“生产型”细胞量是单罐谷氨酸产量的关键，其取决于发酵罐的溶氧条件和生物素的适宜用量。 从以上三个图看，我们可以发现，发酵中耗糖慢，产酸低，糖酸转化率低，OD值增长缓慢。为什么会出现这种异常发酵呢？镜检看，菌体个头小、发圆，产酸越低，菌体越小、越圆，甚至看似球菌而不是棒杆菌，排列不整齐不规则。异常发酵的菌体个小，发圆，那是由于菌体分裂后生长缓慢所造成的。之所以分裂后的菌体生长缓慢就是因为发酵培养基中有不适合或阻碍菌体生长的因素存在，也就是说，这种的发酵环境不适合或阻碍了菌体的迅速生长发育，使菌体分裂后不能迅速长大，所以镜检看来菌体是小个，发圆的。同时，由于菌体不能迅速长大，生物素大量过剩，也就造成菌体一方面在继续适应恶劣环境，一方面适应后又在缓慢的生长，0D值在缓慢增加。
4 小结讨论 就像上面提到的是什么原因造成发酵培养基环境恶劣的呢?原因比较复杂，但主要是由于发酵污染和原料质量差造成的，如糖液变质或其中焦糖或色素过多；玉米浆、糖蜜变质、变味；无机原料质量不合格，杂质太多等等。这其中容易被忽略的是无机原料中的磷酸氢二钠。有的发酵工厂使用的磷酸氢二钠质量很差，甚至是假冒伪劣产品。这样的磷盐配人发酵培养基后常常会出现上述异常现象。因为这样的磷盐含磷少，又难溶于水，尤其是冷水，进入发酵罐后，起初磷不足菌体利用困难，造成菌体细胞合成困难，生长缓慢。因而发酵前期生物素过剩，影响菌体转型产酸，耗糖慢、产酸慢，最终结果是产酸低，糖酸转化率低。 关于污染问题，危害最大。杂菌污染不仅导致杂菌争耗营养，而且产生的代谢产物中的毒素严重的影响生产菌的生长繁殖。在谷氨酸发酵生产中，通常所说的染菌包括两种：一是感染谷氨酸噬菌体，也是最严重的一种染菌，发酵罐一旦感染上噬菌体，谷氨酸菌体量在很短的时间内迅速下降，发酵将无法继续进行。 针对以上的问题，我们在谷氨酸的发酵中，采取有效的控制预防措施保证发酵正常进行，减少损失，提高企业经济效益：1、稳定淀粉乳和葡萄糖液质量，做好流加糖及生物素的设计；2、采用混合生物素、糖蜜、玉米浆质量要稳定；3、严格执行设备检查及环境灭菌制度，保证发酵罐内的良好环境；4、完善供风系统，提高发酵罐中的溶解氧；5、把好离交废液排放关，合理利用发酵废液进行其他的生产。 影响谷氨酸发酵的因素很多，随着生物技术、计算机自控技术的提升相信谷氨酸发酵控制技术也会不断的刷新，谷氨酸发酵控制技术论文也会不断的改写。