DNAMAN
目的基因
首先要拿到自己要设计引物的目的基因。这里我使用一段GFP基因给大家讲解。将目的基因保存在txt文档里面，或者直接复制下来后在DNAMAN里面新建文档复制进去。下面是我们要设计引物的GFP基因序列。
打开DNAMAN，选择菜单里面的Primer-->Load Primer-->From Input。将上一步中的目的基因序列从开头开始的20个左右的碱基复制粘贴进去(引物长度要在15—30bp之间，常用的是18-27bp)，比如我们先试试前20个碱基是否合适，将ATTGATGTGATATCTCCACT这20个碱基复制粘贴进去，点击OK。
再次点击Primer，选择Melting Temperature，打开对话框。这里面可以看到你的碱基序列，个数以及Thermo，也即Tm值，是溶解温度。Tm值一般在55℃到70℃之间比较好，PCR仪的退火温度一般设定比primer的Tm低5℃（不过一般情况我们都设定为55℃，因此Tm值在60左右比较好）。
从上图可以看到我们这20个碱基的Tm值只有49度，显然太低，需要增加碱基数量。我们取前24个碱基粘贴进去，点击下方Show Tm便可以看到这个引物的Tm值，发现是60.3度，很合适，就用这个了。这样正向引物就设计完了，把这24个碱基序列保存下来。
设计反向引物需要将目的基因序列进行反向互补，然后按照正向引物一样的方法设计便可。反向互补操作可以在DNAMAN里面快速方便进行。
打开DNAMAN，选择左侧第一个Channel，然后点击菜单栏的Sequence-->Load Sequence-->From Sequence File…将我们保存目的基因的txt文档导入到软件中。【打开txt文档的时候记得在打开窗口中的文件类型里面选择All Files】
可以看到序列被导入到了第一个Channel，双击这个Channel便可以看到我们的序列的详细信息。
保持Channel 1选中的状态，选择Sequence-->Display Sequence，打开对话框。
选择对话框中的Reverse Complement Seq，其他的复选框都取消。然后点击OK。
这样就可以看到目的基因的反向互补序列了。
对这个反向互补序列进行和上面设计正向序列引物一样的操作，设计引物便可。具体的不再啰嗦，我直接把我的设计结果告诉大家：选择前24个碱基，也即TCAAAGATCTACCATGTACAGCTC，Tm值为57.6，比较合适。到此引物设计就结束了。拿着刚才设计的正向引物和这里设计的反向帮我们合成引物了。
至于拿到引物后如何使用PCR仪扩增目的基因，相信大家实验室都有会操作的人，简单教一下就会知道。如果有不知道的可以在这个经验下面提问我，我可以根据情况再写一篇如何使用PCR仪的经验。