纳豆激酶提取方法

（1）将购买或从纳豆中分离筛选得到的菌株接种到液体培养基中，37℃恒温培养，4 000 rpm离心30min，取上清液，即为粗酶液。（2）用硫酸铵分级沉淀的方法除去杂蛋白、多糖等。取上清液缓慢加入硫酸铵至25％饱和度，低温过夜，4 000 rpm离心30 min去除杂蛋白，再取上清液，在上清液中再加入硫酸铵至终饱和度为60％，低温过夜，4 000 rpm离心30 min除去多糖类物质，收集沉淀，溶于缓冲液中，得到的为粗酶液。

（3）粗酶液经透析脱盐，除去硫酸铵。（4）为了最终获得符合要求的产物，将样品进行多级层析，目的是先层析浓缩样品和去除杂质，再层析去除残存杂质、目的蛋白的多聚物或降解片段。凝胶层析和离子交换层析可提出较高纯度的酶，但是应注意层析介质的选择。将发酵液经硫酸铵沉淀后通过Superdex 75凝胶层析和SP Sepharose Fast Flow离子交换层析[8］，发现经硫酸铵沉淀后得到的粗酶中杂蛋白不多，凝胶过滤可分离一部分杂蛋白，再经离子交换层析后，电泳可得到单一条带的纳豆蛋白产品，Mr为27 700。以上每一步都要进行酶的活性测定。测定方法为：纤维蛋白块溶解时间( CLT) 法。[9]

该法也是参照t2PA、尿激酶等溶栓物质活性测定方法加以改进而建立的。具体方法：0 ℃下,在小试管中依次加入凝血酶、巴比妥钠缓冲溶液、纳豆激酶样品溶液和纤维蛋白原,强烈搅拌,置于37 ℃恒温水浴中。从纤维蛋白形成起开始计时, 随着反应液混浊,有气泡上升到液面,至气泡不再冒出时所用的时间作为纤维蛋白溶解的时间。同样以标准纳豆激酶或尿激酶、纤溶酶等作为标准品绘制标准曲线。以CLT 对纳豆激酶浓度的对数作图, 在10 ～ 70μg 范围内有很好的线性关系。