在新宿街头的其中一条后巷有一家小食堂，由老板独自经营，这家食堂很特别，营业时间是深夜时到早上七时左右，因此也被熟客称为深夜食堂。
虽然菜单里只有豚汁套餐、啤酒、日本酒、烧酒，每位客人限点三杯酒，但老板表示，除此之外，只要敢点老板就能做。
茶泡饭在日本人心中占有很重要的地位，即饮即食，可以在最短的时间内充饥提神，在煮好的米饭上浇上热茶，加点配料来吃，有三个关系很好的女生每晚都来深夜食堂点这道料理。
美纪茶泡饭会加上梅干，留美吃茶泡饭会加上鳕鱼子，加奈吃茶泡饭会加上三文鱼，老板给三人起名叫做茶泡饭三姐妹。但是曾经一起相约坚持梦想的三人因为留美的回乡而产生了矛盾。
留美的家人觉得留美是时候结婚生子过安静的生活了，于是被动摇的留美开始在老家相亲，其他两人对留美十分失望，留在城市里拼搏的两个姐妹也不太平，加奈竟然和美纪的前男友谈起了恋爱。
美纪好心去阻止两人的关系，结果却被加难误认为是嫉妒和挑拨离间，伤心的美纪独自跑到深夜食堂吃梅干茶泡饭，开始自言自语地向老板诉说心事，后来加奈也来了。
两人互相交换品尝了对方的茶泡饭，发现原来也是同样的美味。两个好朋友就这样重归于好，不久后留美也相亲失败归来，茶泡饭三姐妹也重出江湖了。
红香肠是将小香肠从中间切十字刀，然后放到七成熟的油锅里煎炸，炸的时候不停翻转，使章鱼触角都充分张开，在黑社会混迹的头目阿龙最喜欢吃的菜就是八爪鱼红香肠。
阿龙的身边永远跟着一个小弟，大晚上带着一副墨镜，每次出场都会把深夜食堂里客人吓得大气都不敢出，但阿龙居然意外的和食堂里的另一个常客同性恋酒吧老板成了朋友。
成为同性恋者48年的酒吧老板最喜欢的食物是玉子烧，两人开始交换食物，开始交换彼此的生活，于是两个生活在社会边缘的人有了共同话题，当别人都躲着两人，对两人抛冷眼的时候，当全世界都忘记两人的时候，两人却通过简单的食物相互慰藉，人都是孤单的，有时候陌生人可能会成为你最大的精神支柱。
米饭刚刚煮出来的样子很诱人，雪白松散粒粒蓬松，仿佛入口即化，将鲣节片放在热乎乎的米饭上，再浇上酱油或者味增拌着吃很香，猫也会吃的有滋有味，所以这份料理也叫猫饭。
美幸很热爱唱歌，嗓音如同天籁，但一直没机会出名，美幸经常会来深夜食堂点一份猫饭，然后细细品尝，老板把美幸的CD拿出来给食客们听，一下子就征服了深夜食堂里的所有人，甚至是最挑剔刻薄的几个女食客。
美幸在这里得到了大家的赏识，没过多久真的出名了，可惜天妒英才，刚刚成名的她却得了重病，不久后便去世了。而在美幸去世后，有一只猫来到深夜食堂，每次吃到猫饭都会冲老板喵一下。
舌尖上的中国总编导陈晓卿曾这样评价深夜食堂：最平凡的食物里永远能品味到最不平凡的百味人生。