毕氏酵母PEG1000转化法
工具/原料
1
缓冲液A:1.0M Sorbitol,10mM Bicine,pH8.35(sigma),3%(v/v)ethylene glycol
2
缓冲液B:40%(w/v)PEG1000(sigma),0.2M Bicine,pH8.35
3
缓冲液C:0.15M NaCl,10mM Bicine,pH8.35
4
未污染的新鲜、试剂级DMSO,-70℃保存
方法/步骤
1
待转化毕氏酵母的制备
2
接种环接种Pachia pastoris于YPD平板,30℃培养2d;挑取单克隆酵母菌株于10mlYPD培养基中,30℃振荡培养过夜;
3
取少量菌液接种到100mlYPD培养基中振荡培养,待其OD值从0.1升到0.5~0.8;
4
室温下3000g离心收集酵母菌体,50ml缓冲液A洗涤一次;
5
重悬菌体于4ml缓冲液A中,按0.2ml/管分装于1.5ml的离心管中,每管加入11ulDMSO,混合后迅速于液氮中冷冻,-70℃保存
6
毕氏酵母的转化
7
将约50ug线性化质粒DNA溶于20ul TE或水中,直接加于冻结的酵母细胞中;加入担体DNA(40ug变性超声线性化鲑鱼精DNA)以获得最大转化率;
8
37℃水浴孵育5min,中间混合样品1~2次;取出离心管,加入1.5ml缓冲液B,彻底混匀;30℃水浴孵育1h;
9
室温下2000g离心10min,去除上清液,菌体沉淀重悬于1.5ml缓冲液C中;离心样品,去除上清液,轻微操作将样品重悬于0.2ml缓冲液C中;将所有转化液铺于选择性平板,于30℃孵育3~4天后,鉴定;
注意事项
1
缓冲液A、B、C均用滤膜过滤,-20℃保存;
2
将DNA直接加在冻结的酵母细胞上是本实验的关键之处(即使在冰上解冻的待转化细胞,其摄取外源DNA的能力也在解冻过程中迅速下降;如进行多样品的转化,建议按6样品/组进行);
上一篇:有趣的休斯顿旅游攻略
下一篇:酵母菌培养液的配制是什么