设计好引物,需要使用的试剂
1. PCR反应(同前) PCR产物经琼脂糖电泳确认。
2. PCR反应结束后,取5μl扩增产物加10μl甲酰胺上样缓冲液混匀,98℃ 变性10分钟,迅速冰浴
3. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。 (1)制备50 ml 6%非变性聚丙烯酰胺凝胶,加 TEMED 25 μl、10%过硫酸铵250 μl,混匀后灌胶,插入加样梳子。待胶完全聚合后,拔出加样梳子,安装电泳装置,加入1´TBE电泳缓冲液,缓冲液应高于加样孔上缘,用注射器吸取缓冲液冲净加样孔。 (2)取已变性的5 μl PCR扩增产物加到点样孔中,以20 V/cm 电泳 4~5小时。 (3)拆下电泳装置,取出聚丙烯酰胺凝胶,放到一个塑料盘内,用蒸馏水冲洗1~2遍。 (4)倒入固定液,固定 8~10分钟。 (5)用蒸馏水冲洗1~2遍;倒入银染液,银染10~12分钟。 (6)用蒸馏水冲洗若干遍;倒入显色液,显色至出现清晰的银染带。 (7)用蒸馏水浸泡聚丙烯酰胺凝胶,观察PCR-SSCP结果。
PCR扩增后的DNA片段经变性成单链后在不含有变性剂的中性胶中电泳,与正常比较出现泳动带的变位即可推测存在碱基置换。其碱基置换的性质必须经过DNA测序才能确定。因此PCR-SSCP检测是测序之前突变筛查的常用手段。 为了便于观察分析结果,PCR扩增体系中常加入a-32P dNTP标记PCR产物,电泳后放射自显影观察泳动带的位置。目前也常用银染法来染色聚丙烯酰胺凝胶上的DNA泳动带,此方法可避免同位素的污染及对操作者的辐射损伤,但其灵敏度不如用同位素标记。 单链DNA片段的立体构象主要与碱基序列相关,但也受到其他条件的影响。因此,PCR-SSCP技术的关键在于电泳时的诸多条件,如凝胶的组成、电泳的温度、离子浓度以及影响分子内相互作用的其他溶质等。 PCR-SSCP的缺点是存在假阴性和假阳性,一般对长度不超过300bp的待测片段的检出率为70~80%。