不少人都不会设计QPCR引物或者用专门设计QPCR的软件进行设计，导致QPCR引物设计过程繁琐。今天来教大家一种比较简便的设计QPCR引物的工具。
工具/原料
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pubmed数据库（Home - PubMed - NCBI）
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QPCR引物要求
方法/步骤
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第二：进入pubmed主页后，将左上角的pubmed改成Ncleotide，在Advanced的上方空白框内输入你要设计的引物的名称，（比如趋化因子3，CCL3）种属（比如大鼠，Rattus），和mRNA。点击search。
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第三：第二步完成之后会弹出很多条目的引物，选择你要的引物的mRNA那个模块。点击进入查看。
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第四：第三块完成后会弹出你选择的引物的基本信息，包括引物出自哪篇文献，名称是什么，种属是什么，文献的题目和作者是什么等等跟引物相关的信息，此时挑选文献影响因子比较高，证明你选的引物引用度比较高，引物本身质量会比较好。（比方CCL3这条引物，来自文献Anesthesiology 120 (6), 1491-1503 (2014)，影响因子和时间都比较好，可以选）
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第五：第四步挑选完成之后点击右上方的Pick Primers。
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第六：完成第五步后会弹出一个网页，其他部位的数据都不要修改，只修改PCR product size和PCR melting temperatures这两个部位的数据。分别修改如下图所示。
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第七：完成步骤六后点击该网页最左下方的get primers。会弹出新网页，再点击新网页的check，即出现可供挑选的QPCR引物。
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第八：根据QPCR引物的设计原则，我们需要挑选QPCR产物最短，温度最接近，GC越接近45%的，并且前导链和后随链的GC值都比较接近的，出现AT的数目不是很多的，并且引物特异性好，少存在转录变异副本之类的引物为最佳引物。
注意事项
严格掌握QPCR引物设计的要求，挑选最佳引物。
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