样本、血清、血浆、细胞培养上清、细胞裂解液、组织匀浆液、尿液、唾液等其他液体生物样本
血清血清是最常用于ELISA检测的一类样本，处理也比较简单。用无热原、无内毒素的试管或离心管采集血液标本，将试管或离心管室温放置2小时或4℃过夜，使血清析出。（最好将试管或离心管倾斜放置，使液面横截面增大，能使血清更大程度的析出。）4℃ 1000×g离心20分钟，仔细收集上清。建议将血清分装多份，-20℃或-80℃保存，避免反复冻融。采血过程中应避免溶血，因为红细胞裂解时会释放具有过氧化酶活性的物质，在以HRP为标记的ELISA检测中会有非特异性的显色，而导致检测的不准确性。同时也应避免细菌污染，因为菌体内可能含有内源性的HRP从而导致检测的假阳性。
血浆用含抗凝剂的采血管或离心管采集血液标本，标本采集后30min内4℃ 1000×g离心15min，取上清即血浆。将上清分装多份，-20℃或-80℃保存，避免反复冻融。避免使用溶血或高血脂的标本。常用的抗凝剂为EDTA、肝素钠和枸橼酸钠等，检测时还应仔细阅读试剂盒说明书，检查试剂盒是否对抗凝剂有特殊要求。
细胞培养上清取细胞培养上清到离心管，1000×g离心20min，除去细胞碎片及杂质，取上清，-20℃或-80℃保存，避免反复冻融。
细胞裂解液1）吸去培养板内的培养基，用胰酶消化细胞，加适量培养基将细胞从培养板上吹下来。悬浮细胞可省略。2）收集细胞悬液，1000×g离心10min，弃去培养基，用预冷的PBS润洗3次。3）加入适量的预冷PBS或细胞裂解液（临用前加入蛋白酶抑制剂）重悬细胞。通常6孔板一个孔的细胞量需要150~250μL PBS重悬。4）将样品放入-20℃或-80℃，使样品冷冻，再放室温解冻样品，反复冻融几次，使细胞充分裂解。也可将样品进行超声破碎，以达到裂解的目的。5）4℃ 10000×g 离心10min，除去细胞碎片，取上清，-20℃或-80℃保存，避免反复冻融。
尿液、唾液等其他液体生物样本1000×g离心20min，取上清即可检测。总的来说，因为ELISA只能检测可溶性蛋白的含量，所以应保证所有样本均为澄清的液体，沉淀或悬浮物都应离心去除。
为了保证检测的准确性，保存于-20℃或-80℃的样本最好在1~6个月内检测；4℃保存的样本应在1周内进行检测。
另外，还应保证样本不含NaN3，因为NaN3会抑制HRP的活性，从而导致假阴性的结果。