脐血中分离干细胞-改良HES分离法

脐带血干细胞改良HES分离法是将传统的HES分离法进行优化和改进，在后期给予氯化铵将红细胞液的体积缩减与分离。详细的操作步骤如下:1.确保操作时在无菌的环境下进行，因而需要准备超净台对穿刺部位进行消毒；2.然后将6%的HES(羟乙基淀粉)分别按照脐血血量的1/4加入到采集来的血袋中；3.混合均匀后使用无菌封口胶密封穿刺点，倒置与10℃的低温环境中静置6小时；4.分离好后先将脐血下层的红细胞缓慢的放出，取50ml离心管置于其中，然后将血浆放入另一只50ml离心管中；5.把盛有红细胞的离心管，室温、600r/min、离心5分钟，把上层的血浆部分吸出后置于另一只盛有血浆的50ml离心管中，将剩下的红细胞丢弃即可；6.把收集血浆的离心管，室温、600r/min、离心5分钟，取上清部分保留在50ml离心管中，将下层红细胞去除；7.将上步中收集的上清液室温、1200r/min、离心10分钟，去1ml上层血清作为备用，将其他上清去除，将含有核细胞下层部分浓缩至约5ml，用PBS 将体积调整至25ml；8.重复上步操作3次，将最终得到的细胞用PBS调整体积支5ml；9.将得到的有核细胞液与氯化铵破红细胞液(NH4CL)按照1:1的比例进行混合，室温、800r/min、离心10分钟，弃上清所有的下层细胞用PBS反复清洗3次，重悬细胞于上述步骤7作为备用上清液，然后将体积调整至1000μl；10.用微量移液器吸取包细胞稀释液0.49ml转移至EP管内，加入10μl细胞悬液混匀后，在低倍镜下计算池四角的四个大方格的有核细胞数，将其总数×125 , 即得到1μl 悬液内的有核细胞数；11.用微量移液器去0.49mlPBS液移至EP管中，加入有核细胞悬液10μl混合均匀后加入0.5的台盼蓝染液100μl再将其混合均匀后等待2分钟，制片镜检计数；12.取NC混悬液50ul用流式细胞仪检测人源性CD34 +细胞的含量，具体的方法如下:(1)在上机试管底部加入50μl 样品；(2)加入单克隆抗体CD34-PE10ul混匀；(3)避光室温孵育20分钟，加入500μl 红细胞裂解液充分混匀；(4)室温静置20分钟后加入PBS也500μl充分混匀；(5)上机检测。13.去10ul的有核细胞悬液进行需氧菌、厌氧菌和霉菌培养，需氧性与厌氧性杂菌培养均采用硫乙醇酸盐培养基，霉菌与腐生菌培养均采用改良马丁培养基，然后将其分别置于30-35摄氏度和20-25℃的培养箱中培养14天，后观察结果即可。