Real-time PCR检测Pm-cyclin Y的mRNA分布方法

首先，取9尾健康成熟的斑节对虾(体重大约150g)的卵巢、肝胰腺、脑、肠和胃等10个组织，用Trizol试剂手提法提取各个组织的总RNA。

然后，测定其纯度和浓度，并于80C保存。通过石蜡组织切片，研究确定斑节对虾卵巢的分期(I:原生质细胞阶段，II: 核染色质期，II:  周边核仁期，IV:  卵黄囊期，V:成熟期)。

然后，提取卵巢发育各期的总RNA,测定其纯度和浓度，80°C保存。将每3尾虾对应组织的总RNA混合作为一组，这样每个组织就得到了3组样品作为平行样，每组样品供3次实验重复操作。

然后，分别取1 μg各组织和发育各期卵巢的RNA作为模板，按照PrimeScript RT reagent Kit With  gDNA Eraser(PerfectReal Time, TaKaRa)的使用说明进行逆转录。

然后，所得cDNA用p-actin引物检测，显示无杂带，稀释8倍，分装并放置在-80°C， 作为备用模板。设计特异性引物Cy-F(5'-CCCCTAAGTAAAGAACGA-3)和Cy-R(5-CAGAATAGCCACTGAACG-3)，内参基因EF-la的引物EF-F(S'-ATGGTTGTCAACTTCCCC-3)以及EF-R(S'-TTGACCTCCTTGATCACACC-3)。

最后，参照latium SYBR Gren qPCR Super  MixUDGlwitrogenKit的使用说明，分别利用这两对引物进行实时交化定量PCR扩增。