毕氏酵母感受态细胞制备及转化（法一）

1M LiCl（用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌；必要时用消毒去离子水稀释）

YPD培养基

感受态毕氏酵母的制备接种Pachia pastoris到50ml YPD培养基中，30℃摇菌过夜（约24～28h）培养到OD值为0.8～1.0（约108 Cells/ml）

收获细胞，用25ml无菌水洗涤一次，室温下1500g离心10min；重悬细胞于1ml 100mM LiCl溶液中，将悬液转入1.5ml离心管；

离心机最大速度离心15秒沉淀菌体，重悬菌体于400ul 100mM LiCl溶液中；按50ul/管分装，立即进行转化；注：不要将感受态酵母菌冰浴；

将感受态酵母菌离心，以Tips去除残余的LiCl溶液；

对于每一个转化，按以下顺序加入：50% PEG3350                      240ul1M LiCl                           36ul2mg/ml 单链Salmon sperm DNA       25ul5～10ug/50ul H2O 质粒DNA          50ul

剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀（约1min）；30℃水浴孵育30min；42℃水浴热休克20～25min;6000～8000rpm离心收集酵母菌体；重悬酵母于1ml YPD培养基，30℃摇床孵育；

1～4h后，取25～100ul菌液铺选择性培养基平板，于30℃培养2～3天鉴定。