Human IFN-γ ELISpot Kit (3420-2H, Mabtech)
96孔PVDF膜培养板 MultiScreen Filter Plates (Millipore Corp. # MSIPS4W10)
无菌PBS溶液
35%乙醇（无菌水配制）
PRMI1640 培养液以及胎牛血清（GBIQ)
二甲亚砜（DMSO）（SIGMA）
TMB substrate （Mabtech #3651-10）
第一天：准备ELISpot板子以及包被抗体过夜。a. 按照试剂盒提供的浓度（也可摸索适合自己实验的浓度）将一抗（包被抗体）稀释在无菌的PBS（pH7.4）中；b. 用15μl 35%乙醇对培养板中需要的孔进行预湿，预湿时间每孔不超过1min；c. 用PBS溶液清洗五遍，200μl每孔；d. 包被：将稀释好的包被抗体按照每孔100μl加入，孵育过夜。如需长时间保存，可用封口膜将板子四周封闭，防止污染。
第二天：准备细胞并进行培养。a. 将第一天包被的抗体溶液倒掉并用PBS清洗板子至少5遍，200μl每孔；b. 封闭：往每孔中加入200μl配制好的含有10%胎牛血清的PRMI 1640培养基，37℃孵育2小时；c. 准备需要刺激的细胞： 1）. 如果是细胞系，则只需将细胞从原本的培养体系中通过离心分离出，然后进行细胞计数，稀释到一定的体积（按照每个孔200μl，每个孔所需要的数目需要根据不同的试验自行摸索条件）； 2）.如果是人PBMC，请先参考我的另一篇”人外周血单核细胞（PBMC）分离及培养“。分离出PBMC之后，对细胞进行计数，然后按需用含有10%胎牛血清的PRMI 1640培养基稀释到一定的体积；d. 对封闭结束的板子进行如上的清洗；e. 加入195μl细胞到每孔，细胞数事先已经调整至需要的浓度；f. 每个孔加入5μl不同的刺激物：一般为合成多肽段或多肽库，阴性对照为相同浓度的二甲亚砜（DMSO），阳性对照一般为一定浓度的植物凝集素（PHA：参考10-20μg/mL）或者刀豆蛋白（ConA: 参考5-10μg/mL）；g. 在37℃ 5%CO2培养箱中培养24-48小时。
第四天：检测细胞因子并读取结果a. 去除每孔中的培养细胞，同上清洗5遍；b. 用含有0.5%胎牛血清的PBS溶液（PBS-0.5%FBS）稀释监测二抗至试剂盒推荐浓度，每孔加入100μl，常温孵育2小时；c. 同上清洗每孔；d. 用PBS-0.5%FBS稀释检测抗体（Streptavidin-HRP）（1:500），每孔加入100μl，常温放置1小时；e. 同上清洗每孔；f. 每孔加入100μl TMB显色底物，显色至膜上出现明显的斑点（一般10min之内即可出现），倒掉TMB底物，并立即在水龙头下用清水冲洗；g. 将清洗完成的板子放置于通风橱中吹干；h. 用合适的读板器（ELISPot Reader）进行读板并计数。
细胞数：多肽刺激一般推荐2x10^5 左右；阳性对照一般2x10^4左右。
涉及到感染类病毒，在去除细胞的一步中，应当进行灭活病毒处理，防止后续操作中感染病毒外泄：包膜病毒可在去除细胞过后加入100μl 1% Triton X-100 孵育30min；非包膜病毒可在去除细胞之后加入200μl 4%多聚甲醛常温放置5min。从而彻底杀灭孔中可能存在的活病毒，再进行后续操作。
包被抗体：推荐5-10μg/mL/well，4℃至少孵育16h。
板子保存：由于板子包被抗体之后，保存期很长，所以可以事先包被很多板子，以避免每次试验都需要提前小量提前准备。一般可4℃密封保存7天。也可在封闭的过程中长期保存。
斑点特征： 1. 有一个深色的中心，周围有一圈逐渐变浅的晕； 2. 颜色深浅和spot大小取决于细胞因子分泌的多少； 3. 计数的时候应该只记录特征明显，斑点信号强，斑点大的，小而模糊的斑点可能是背景杂质或者是先天免疫系统免疫细胞分泌的少量细胞因子； 4. 背景中出现的很多小且深色的斑点，但他们一般缺乏边缘的晕。产生的原因可能是由携带有目的细胞因子的细胞膜破碎之后的碎片，被检测到了; 5. 斑点的大小一般在30-150μm左右。
条纹状斑点：出现的原因可能是由于在孵育过程中，板子出现了晃动，导致分泌细胞出现了位移。一般尤其注意孵育过程中避免培养箱的晃动。
预湿过程：由于是使用的乙醇对膜进行的预湿，所以预湿过后的清洗显得尤为重要，如若清洗不净，残存的乙醇将对细胞的培养以及抗体的包被产生很大的影响。
同一批实验板子，在读板的时候应当使用相同的gate。
TMB显色底物，如果单买的话，建议买Mabtech。并且注意一定是膜显色底物，而不是溶液显色底物。另外如果买一般的国产品牌，那就坐等实验失败了。
最后显色一步，一般好的显色底物10min以内斑点就非常清晰，如果超过10min之后，还一点斑点都没看到。那要么是实验操作的问题，要么就是试剂的问题。