（1） 滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于已知抗原标本片，10min后弃去，使标本片保持一定湿度。
（2） 滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS适当稀释的待检抗体标本，覆盖已知抗原标本片。将玻片置于有盖搪瓷盒内，37℃保温30min。
（3） 取出玻片，置于玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗1-2次，然后按顺序过0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸5min，不时振荡 。
（4） 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，滴加一滴一定稀释度的荧光标记的抗人球蛋白抗体。
（5） 将玻片平放在有盖搪瓷盒内，37℃保温30min。
（6） 重复操作3。
（7） 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，滴加一滴缓冲甘油，再覆以盖玻片。
（5） 立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示： （-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（++）荧光明亮；（+++ --++++）荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为（±）或（-），即可判定为阳性。
（1）荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长 ，会使荧光减弱。
（2）染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10 min到数小时，一般30 min已足够。染色温度多采用室温（25℃左右），高于37℃可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用0-2℃的低温，延长染色时间。低温染色过夜较37℃30 min效果好的多。
（3）为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置对照，以排除某些非特异性荧光染色的干扰。
（4）已知抗原标本片需在操作的各个步骤中，始终保持湿润，避免干燥。
（5） 所滴加的液体应始终保持在已知标本片上，避免因放置不平使液体流失，从而造成非特异性荧光染色。
（6） 一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象，经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降