目前最常用的提前细胞RNA的方法是Trizol法,然而如何更高效的提前RNA需要注意哪些问题呢?
工具/原料
1
冰盒、手套、口罩、75%乙醇、氯仿、Trizol、去RNA/DNA酶水
2
细胞、去RNA/DNA酶的枪头、EP管
方法/步骤
1
弃去培养瓶中的培养液,用PBS液清洗2次,贴壁细胞用0.25%胰酶消化,悬浮细胞直接用1000rpm,4℃离心5min,离心,PBS洗涤2次。
2
戴口罩、手套在冰盒上加入lmL的Trizol,反复吹打细胞或用振荡器震荡5min后待细胞裂解完全,仍在冰盒上将裂解液移至Eppendorf(Ep)管中加入氯仿200 pL,剧烈震荡15s,冰盒上静置2-3min。
3
12000rpm,4℃离心15min移取上清至新的Ep管中,加入500uL异丙醇,混匀后冰盒上静置10min。
4
12000rpm,4℃离心10mim倒掉上清,用75%乙醇lmL洗沉淀,4℃7500rpm离心5分钟,弃上清,空干,可放在通风橱中加快风干。
5
加入去离子水溶解RNA;测量RNA的纯度和含量
注意事项
注意事项,全程戴口罩、手套,枪头、水一定无酶,全程一定在冰盒上操作。